Способы постановки реакции преципитации. Реакция преципитации. Механизм. Компоненты. Применение Реакция преципитации не используется
Реакции преципитации (от лат. precipitation - стремительное падение вниз) основаны на формировании и осаждении (выпадении в осадок) комплекса растворимый молекулярный антиген - антитело в присутствии электролита.
Максимум преципитации достигается при смешивании растворимых антигена и антитела в эквивалетных или близких к эквивалентым количествах. Для получения реакции преципитации антиген в возрастающих концентрациях добавляют к раствору антитела. Количество осаждающихся иммунных комплексов вначале возрастает, а затем падает. В кривой преципитации можно выделит три зоны:
- избытка Ат (количество добавляемого антигена недостаточно для того, чтобы связать все антитела);
- эквивалентности (когда все Ат и Аг связаны в комплексы);
- избытка антигена (количество антигена превышает необходимое для связывания всех антител).
Рис. 18. Кривая преципитации
Различают несколько разновидностей реакций преципитации.
Реакции кольцепреципитации . В узкую пробирку наливают иммунную сыворотку, содержащую антитела, затем сверху осторожно наслаивают раствор, содержащий растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.
Рис. 19. Реакция кольцепреципитации
Радиальная иммунодиффузия по Манчини - метод, позволяющий количественно определять антигены и антитела.
Антитела смешивают с агаровым гелем, затем полученную смесь наносят на предметные стекла и оставляют для застывания. В застывшем геле вырезают лунки, вносят в них раствор антигена в различных концентрациях и оставляют не менее чем на 24 ч. Антиген диффундирует в гель, связывается с антителами, и при достижении точки эквивалентности происходит осаждение комплексов антиген - антитело в виде кольца, диаметр которого прямо пропорционален концентрации антигена. Таким способом получают калибровочную кривую, с помощью которой можно количественно определить исследуемый антиген.
Кольцо преципитации
Рис. 20. Калибровочная кривая
Для количественного определения антител применяют этот же метод в обратной последовательности: в гель добавляют антиген, а в лунки - антитела.
Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации. Смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью элекрофореза, затем в канавку параллельно зонам элекрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии преципитации.
В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул. Это могут быть белки, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты, различные дизаты или фильтраты бульонных культур микробов. Антитела, участвующие в реакции преципитации, называют преципитинами. Образующийся мелкодисперсный комплекс антиген — антитело выявляется при определенных методах постановки реакции преципитации.
Реакция кольцепреципитации предложена впервые Асколи. Ее используют при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии, менингита. Метод прост и доступен.
В узкие преципитационные пробирки разливают специфическую иммунную преципитирующую сыворотку и на нее очень осторожно наслаивают антиген. В качестве антигена берут, например, при диагностике сибирской язвы кусочки кожи, шерсти, шкуры павшего животного и др. Их кипятят, жидкость фильтруют и используют как антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца — преципитата свидетельствует о наличии соответствующего антигена.
Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузионной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водорастворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более густой агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в разных участках геля, где и образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген — антитело. Реакцию преципитации ставят обычно при комнатной температуре.
Метод иммуноэлектрофореза получил широкое распространение в последние годы при исследовании антигенной структуры микробов. Комплекс антигенов помещают в луночку, которая находится в центре агарового геля, залитого на пластинку. Затем через агаровый гель пропускают электрический ток, в результате чего различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в поле электрического тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген — антитело появляются линии преципитации.
Реакция преципитации является очень чувствительным методом и ее применяют при исследовании различных белковых и полисахаридных антигенов в судебно- медицинской практике для определения видовой принадлежности пятен крови, спермы, сыворотки, имеющихся на белье и различных предметах. Эту реакцию можно также использовать для выявления различных примесей к молоку, рыбным и мясным продуктам, определения природы белков, входящих в краски старинных мастеров живописи.
Реакция преципитации (РП)– это осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата).
РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской язве, туляремии, менингите, оспе . В судебной медицине ее используют для определения видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенических исследованиях – для установления фальсификации пищевых продуктов. РП отличается очень высокой чувствительностью и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000.
Компоненты реакции преципитации.
1. Антиген (преципитиноген) - это антиген молекулярной природы, находящийся в мелкодисперсном (растворимом) состоянии. Преципитиногены – это различные лизаты или экстракты тканей и др. Преципитиноген отличается от агглютиногена размером частиц антигена. Агглютиноген имеет размеры клеток (это не разрушенные целые клетки), а размеры преципитиногена соизмеримы с размерами молекул (это белки и их комплексы с углеводами или липидами). Раствор преципитиногена прозрачный.
2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови человека или в иммунных диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела.
3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.
Получение преципитиногена .
Получаютпутемизмельчения материала и извлечения из него белковых антигенов кипячением или другими способами.
Примеры преципитиногенов : лизаты или экстракты различных органов и тканей, чужеродная сыворотка крови (сыворотка - это раствор , в первую очередь, различных белков), фильтраты бульонных культур микробов, солевые экстракты микробов, аутолизаты и др.
Получение преципитирующих сывороток.
Получают путем гипериммунизации кроликов соответствующими преципитиногенами. Такие сыворотки содержат антитела к тем преципитиногенам, которыми иммунизировали кроликов.
Примеры преципитирующих сывороток : преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (содержит антитела к антигенам возбудителя сибирской язвы), преципитирующая противоменингококковая сыворотка (содержит антитела против антигенов возбудителя менингита) и др.
Титр преципитирующей сыворотки – это наибольшее разведение преципитиногена, при котором сыворотка еще дает реакцию преципитации.
Способы постановки РП.
1. Реакция кольцепреципитации – проводится в специальных преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Затем осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально.
Учет результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание.
Если в качестве преципитиногена используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция называется реакцией термокольцепреципитации (например, при диагностике сибирской язвы).
2. Реакция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в геле:
а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии : один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата ;
б) метод двойной иммунодиффузии : и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации .
Примером РП в геле являетсяреакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони при диагностике дифтерии
Иммуноэлектрофорез – это метод, который сочетает метод электрофореза и реакцию преципитации. Смесь антигенов (например, белков сыворотки крови) разделяется в геле при помощи электрофореза. Затем, чтобы найти и определить нужный белок (неизвестный антиген), используют диагностическую преципитирующую сыворотку, которая содержит антитела к этому белку (известное антитело). Для этого в канавку параллельно белкам вносится диагностическая сыворотка. Если среди белков имеется тот, который соответствует антителу, находящемуся в сыворотке, то вокруг него образуются линии преципитации .
Заключающаяся во взаимодействии растворимого антигена с антителом с последующим выпадением мелкозернистого осадка (преципитата).
Реакция преципитации позволяет определить в исследуемом материале присутствие неизвестного антигена путем добавления известного антитела или при помощи известного антигена - неизвестное антитело. Преципитация идет хуже в отсутствие солей. Оптимум преципитации находится в диапазоне рН=7,0-7,4.
Механизм преципитации близок к механизму агглютинации. Под влиянием иммунной , прореагировавшей с антигеном, уменьшается степень его дисперсности. Необходимо, чтобы сыворотка и антиген были совершенно прозрачны. При постановке преципитации можно к одному разведению сыворотки добавлять разные разведения антигена либо наоборот.
Преципитация регистрируется лучше, если антиген наслаивать в пробирке на антитело. При этом наблюдается появление преципитата в виде кольца - кольцепреципитация. Кольцепреципитацию проводят в специальных пробирках диаметром 2,5-3,5 мм. Для определения числа антигенов в исследуемом материале или разных антител в сыворотке пользуются реакцией преципитации в агаре: 1% осветленный агар разливают в или на предметные стекла. В разные лунки, сделанные в агаре, наливают растворы антигена и антитела, которые диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации. Реакция преципитации широко используется при диагностике (см. Асколи реакция).
Преципитация в агаре позволяет определять токсигенность дифтерийных культур.
В судебно-медицинских исследованиях преципитация служит для установления видовой принадлежности крови, органов и тканей с помощью специфических преципитирующих сывороток.
Преципитация - реакция осаждения комплекса антигена (преципитиногена) и антитела (преципитина). Преципитация - один из иммунологических феноменов, позволяющих определить содержание антител (см.) в сыворотке крови больных или вакцинированных людей, а также в крови иммунизированных животных. При использовании стандартных сывороток реакция преципитации может быть применена для титрования различных по происхождению растворимых антигенов (см.).
При наиболее простой форме постановки реакции преципитации к ряду пробирок с постоянным количеством антигена добавляют подслаиванием исследуемую сыворотку в серии кратных разведений. После 30-60 мин. инкубации при комнатной температуре на границе двух жидкостей образуется кольцо помутнения - кольцепреципитация. Минимальное количество сыворотки, которое дает реакцию преципитации, принимают за титр антисыворотки. При обратной постановке реакции со стандартной антисывороткой удается оценить относительную концентрацию антигена в различных биологических жидкостях.
Результаты титрования антител и антигенов на основании вышеуказанного метода не имеют абсолютного количественного выражения. С целью количественной оценки содержания антител Гейдельбергер, Кабат (М. Heidelberger, Е. Kabat) и др. разработали количественный метод реакции преципитации, в основе которого лежит обнаружение так называемые зоны эквивалентности. При смешивании возрастных количеств антигена с постоянными объемами антисыворотки количество образующегося преципитата первоначально возрастает, а затем вновь снижается из-за увеличения растворимости комплекса антиген - антитело в избытке антигена. Если определить во всех пробирках содержание антител в надосадочной жидкости, то окажется, что в средних пробирках ряда или даже в единственной пробирке антител в надосадочной жидкости нет; вместе с тем здесь же образуется наибольший по величине преципитат. Поскольку в зоне эквивалентности в преципитат вовлекается также весь антиген, введенный в смесь реагирующих веществ, после вычитания из количества белка преципитата белка антигена получают точную величину содержания антител в данном объеме испытуемой сыворотки. Содержание белка преципитата после тщательного промывания охлажденным физиологическим раствором определяют по азоту или каким-либо колориметрическим методом.
При оценке значения реакции преципитации как диагностического метода необходимо учитывать, что в иммунных сыворотках могут присутствовать антитела, не обладающие свойствами преципитинов и, следовательно, не образующие преципитата при взаимодействии с антигеном. К их числу относятся прежде всего неполные антитела, а также некоторые другие антитела, относящиеся к группе гамма-А-глобулинов.
Способность антисыворотки преципитировать антиген может быть нарушена нагреванием до 65-70°, обработкой органическими растворителями, восстановлением в кислой среде [Изликер (Н. Isliker), А.Я. Кульберг]. Феномен преципитации с антисывороткой, заведомо содержащей преципитины, возможен лишь при определенной температуре, концентрации солей и водородных ионов. Быстрее всего реакция преципитации протекает при 25-37°. Непременное условие образования преципитата - присутствие в изотонических концентрациях хлорида натрия (0,85% раствора NaCl). При увеличении концентрации NaCl до 15% преципитаты, образованные антигеном полисахаридной природы, частично растворяются, чем можно воспользоваться для извлечения чистых антител. Реакция преципитации с антигенами белковой природы протекает с одинаковой скоростью и полнотой как в 0,85%, так и в 15% растворах NaCl. Оптимальная для образования преципитата концентрация водородных ионов соответствует значениям рН от 5,0 до 9,0.
В лабораторной практике находят применение различные модификации реакции преципитации. В частности, реакцию термопреципитации применяют для обнаружения антигенов бактерий сибирской язвы, ботулизма и др., не подвергающихся термической денатурации (коктоантигены). Эта реакция отличается от реакции кольцепреципитации только тем, что в качестве антигена используют фильтрат прокипяченного исследуемого материала (см. А сколи реакция).
При анализе с помощью реакции преципитации сложной смеси антигенов невозможно охарактеризовать свойства отдельных компонентов смеси. Для решения этой задачи прибегают к методам преципитации в агаре и к иммуноэлектрофорезу. Метод преципитации в агаре в наиболее распространенной модификации Оухтерлоню (О. Ouchterlony) основал на том, что антиген и антисыворотка, диффундируя навстречу друг другу в тонком слое агара, образуют при встрече линии преципитации. По числу таких линий можно судить о количестве компонентов, содержащихся в данной смеси антигенов. Метод Оухгерлоню позволяет сравнивать различные антигенные смеси и определять степень родства присутствующих в них компонентов. При анализе сложной антигенной смеси, содержащей вещества с одинаковыми скоростями диффузии в агаре, большую помощь может принести метод иммуноэлектрофореза. Смесь антигенов предварительно разделяют в электрическом поле в пластинке агара, после чего проявляют отдельные компоненты антисывороткой. Антисыворотку вносят в ровик, проделанный в агаре параллельно линии, вдоль которой перемещались при электрофорезе антигены. Каждый из антигенов дает с антисывороткой индивидуальную дугу преципитации. Иммуноэлектрофорез широко применяют для анализа патологических отклонений в белках сывороток, а также при иммунологическом анализе тканевых и бактериальных антигенов.
Преципитация в судебно-медицинском отношении . Преципитация применяется в судебной медицине для установления видовой принадлежности крови, частей органов и тканей. В ряде следственных дел требуется установить видовую принадлежность крови, обнаруженной на орудиях совершения преступления, одежде преступника или жертвы и др. Для реакции преципитации применяют преципитирующие сыворотки, получаемые иммунизацией кроликов, петухов, коз белками разных животных. Обычно изготовляют сыворотки, преципитирующие белок человека, лошади, кошки, курицы, свиньи, собаки, рогатого скота. Они должны обладать титром не ниже 1:10 000 и быть достаточно специфичными. Из исследуемого пятна или корочки крови готовят вытяжки на физиологическом растворе, которые затем испытывают преципитирующими сыворотками. Вид белка считается установленным, если одна из преципитирующих сывороток образует преципитат с вытяжкой из исследуемой крови при соответствующей контрольной реакции. Реакцией преципитации можно установить также вид белка тканей и органов человека или животных. Обычно реакцию преципитации производят в пробирках с конусообразным концом. При получении мутных вытяжек реакцию преципитации производят в агаре по Оухтерлоню.
Особенность этой реакции в том, что взаимодействие антигена с антителом происходит в полутвёрдой среде - геле, чаще агаровом, иногда используют крахмальный гель, полиакриламидный и т. п.
Реакцию преципитации в геле ставят в чашках Петри или на предметных стёклах. Ингредиенты реакции - антиген и антитела - помещают в лунки (колодцы), которые вырезают в агаре.
Различают два метода постановки диффузионной преципитации в агаре: метод простой (или радиальной) иммунодиффузии, когда одно из реагирующих веществ из лунки диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего компонента, и метод двойной иммунодиффузии, когда и антиген, и антитело, помещённые в лунки, диффундируют навстречу друг другу в слое агарового геля. На месте встречи антигена и антитела образуются зоны преципитации (кольцо из преципитата при простой иммунодиффузии и линии из преципитата - при двойной иммунодиффузии). В зависимости от сложности системы антиген - антитело может появляться одна или несколько линий преципитации. Чтобы установить титр преципитирующей сыворотки ставят реакции преципитации с различными разведениями антигена. То максимальное разведение антигена, дающее преципитацию с сывороткой, и является титром данной преципитирующей сыворотки.
Примером реакции преципитации в геле может служить реакция между дифтерийным токсином и противодифтерийной сывороткой, которая носит название реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.
Токсигенные культуры дифтерийных палочек, посеянные бляшками.
Нетоксигенные культуры, посеянные бляшками.
Фильтровальная бумага, пропитанная противодифтерийной сывороткой.
Линии из преципитата.
Агаровый гель.
Иммуноэлектрофорез сочетает метод электрофореза и реакции преципитации. Смесь антигенов разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносится иммунная сыворотка, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии из преципитата.
С его помощью успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения.
Реакции лизиса.
Для этого надо знать:
Иммунный лизис - это растворение клеток под при обязательном участии воздействием антител комплемента.
Для реакции необходимы:
1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.
2. Антитело - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного.
Иммунную сыворотку получают гипериммунизацией кролика соответствующим корпускулярным антигеном (микробные клетки, эритроциты и др.). Например, в реакции гемолиза и реакции связывания комплемента (см. ниже) используется гемолитическая сыворотка, которую получают гипериммунизацией кролика эритроцитами барана; полученная таким образом сыворотка крови кролика содержит антитела (гемолизины) к эритроцитам барана. Таким образом получают и бактериолитические сыворотки, содержащие антитела, участвующие в лизисе бактерий.
3. Комплемент - термолабильный сложный комплекс белков сыворотки крови, при активации реагирующих между собой в определённой последовательности и образующих мембраноатакующий литический комплекс. В сыворотке комплемент находится в неактивном состоянии и активируется в момент образования комплекса антиген - антитело (адсорбируется на комплексе антиген - антитело). Комплемента много в свежей сыворотке морских свинок.
Из реакции лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и реже бактериолиза (главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов).
Постановка реакции гемолиза .
Для постановки реакции гемолиза необходимы:
3 % взвесь эритроцитов барана на изотоническом растворе;
Стандартная гемолитическая сыворотка, приготовленная в производственных условиях и разведённая изотоническим раствором в 2 - 3 раза меньше, чем её титр (титр гемолитической сыворотки - то наибольшее разведение её, при котором происходит полный гемолиз 3 % взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента);
Комплемент, разведённый изотоническим раствором 1:10.
Если в пробирку поместить в определенных количественных соотношениях эритроциты барана (антиген), гемолитическую сыворотку (антитело) и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет изменение смеси: из темно-красной она становится розовой (лаковой) вследствие разрушения эритроцитов и выхода гемоглобина.
Реакция гемолиза обладает строго выраженной специфичностью. Ее используют в качестве индикатора для постановки реакции связывания комплемента.
