Морфология клеток дрожжей. Увеличение числа митохондрий

ДРОЖЖИ - одноклеточные грибки (грибы по бот. клас.), вегетативное размножение которых осуществляется отпочковыванием дочерних клеток, почкованием, сходным с делением, или настоящим делением. Некоторые Д. могут образовывать также разные формы мицелия, т. е. обладают дрожжемицелиальным диморфизмом. Такие Д. иногда выделяют в подгруппу дрожжеподобных грибков.

Наиболее известны Д., вызывающие брожение (см.). Большинство видов Д.- сапрофиты; немногие виды патогенны для человека, животных или растений; они вызывают дрожжевые микозы (см.).

Д. используют в хлебопечении, виноделии, пивоварении, производстве молочнокислых продуктов, спирта, глицерина и т. д.

Термин «дрожжи» охватывает филогенетически гетерогенную группу организмов, к-рую подразделяют на четыре подгруппы: 1) дрожжи - примитивные аскомицеты (см.), входящие в состав порядка Endomycetales; 2) дрожжи-базидиомицеты, принадлежащие к порядку Ustilaginales, представленные родами Rhodosporidium и Leucosporidium; 3) дрожжеподобные грибки, формирующие баллистоспоры, объединенные в семейство Sporobolomycetaceae; 4) дрожжи, у которых не обнаружено ни полового цикла, ни образования баллистоспор, отнесенные к дейтеромицетам. Четвертая подгруппа наиболее гетерогенна. Ее представителей по мере изучения переводят в первые три подгруппы в качестве новых родов и видов.

Большинство клеток Д. имеет размеры 2-3 мкм, но у некоторых видов они достигают 20-50 мкм. По форме они могут быть шаровидными, овальными, цилиндрическими, булавовидными, угловатыми, бутылковидными, веретенообразными, серповидными.

У шаровидных клеток почки формируются на любом участке поверхности, у остальных типов клеток они локализованы ближе к полюсам.

После 5-15 почкований материнская клетка гибнет. У большинства Д. клетки отделяют последовательно по одной почке, но у некоторых (Debaryomyces, Pichia) наблюдается одновременное наличие нескольких почек. При замедленном отделении почек от материнской клетки образуются цепочки из многих клеток, которые классифицируют как примитивный псевдомицелий. Истинный мицелий у Д. формируется, как у всех грибов, и состоит из гиф, разграниченных перегородками - септами. Почки псевдомицелия, образующиеся на концах разветвлений или сбоку на перетяжках, называются бластоспорами. Псевдомицелий и истинный мицелий классифицируют по характеру ветвления, обилию и размерам бластоспор, а также по формированию артроспор, к к-рым относят клетки, образующиеся при распаде нитей мицелия. Яйцевидные или эллипсоидные артроспоры называют оидиоспорами, или опциями. У некоторых Д. (Candida albicans) на псевдомицелии образуются хламидоспоры - крупные шаровидные клетки с плотной двойной стенкой. Перечисленные виды вегетативных спор встречаются у дейтеромицетов и у Д. с выраженным половым циклом. Клетки спороболомицетов образуют заостренные выросты - стеригмы, несущие на кончиках палочковидно изогнутые или симметричные баллистоспоры. При созревании эти споры с силой отбрасываются на расстояние до нескольких миллиметров.

Клетки типичных Д.- сахаромицетов имеют плотную многослойную оболочку (рис. 1). Наружный слой - гладкая липопротеидная мембрана, под ней фибриллярный слой, состоящий из комплекса маннанов с белками. Следующий слой состоит в основном из глюкана, содержащего 94% глюкозы и 6% гексозамина. Между этим слоем и цитоплазматической мембраной выделяют тонкий белковый слой. В состав оболочки входит также хитин (1 - 2%), локализованный в виде гранул. Он имеет нек-рое сходство с хитинами насекомых и иглокожих. Цитоплазматическая мембрана трехслойная, состоит из липопротеидов и образует глубокие инвагинации. Часть мембран ретикулума связана с 80 S рибосомами и входит в состав полисом. С ретикулумом связана также система комплекса Гольджи - параллельно уложенные стопки мембран - диктиосомы, по периферии образующие валик с пузырьками, которых тем больше, чем активнее процессы брожения. Производными комплекса Гольджи являются различные лизосомы: истинные лизосомы, сегрегационные гранулы, центральная вакуоль, обладающая протеолитической активностью, и звездчатые фаголизосомы, которые могут передвигаться и фагоцитировать поврежденные органоиды. Прочие многочисленные вакуоли формируются ретикулумом либо комплексом Гольджи. Некоторые депонируют волютин и липиды, другие изолируют продукты распада. Митохондрии сходны по своей структуре с митохондриями простейших. Их особенностью является большая лабильность обмена, высокая проницаемость мембран, относительно высокое содержание ДНК (1,1-4,3 мкг/мг белка) и 70 S рибосомы, аналогичные бактериальным. Ядро диам. 1 - 2 мкм содержит плотную Фейльген-положительную кариосому. Примерно половина ядра заполнена РНК, к-рой больше, чем ядерной ДНК. Из-за обилия РНК хромосомы плохо различимы. В некоторых ядрах видно веретено в виде пучка трубочек. Расхождение хромосом происходит без резорбции ядерной мембраны. После завершения митотического цикла ядро делится перетяжкой. Дочернее ядро мигрирует в почку. После отделения почки на поверхности материнской клетки остается рубец. Клетки многих Д. окружены капсулой из растворимых фосфоманнанов (Hansenula, Pichia, Pashysolen), полисахаридов (Cryptococcus, Lipomyces, Rhodotorula) или сфинголипидов (некоторые виды Hansenula).

У дрожжеподобных грибков смена типа роста сопровождается изменением состава клеток: у мицелиальных форм больше углеводов, триглицеридов, свободных жирных к-т, меньше стеролов; у дрожжевых форм повышена активность редуктазы дисульфидных связей, что приводит к изменению баланса SH-групп в составе клеточной стенки.

Д. могут существовать в гаплоидном и диплоидном состоянии. Встречаются штаммы с большей или промежуточной степенью плоидности, но это обычно сопровождается нарушением свойственного данному виду жизненного цикла. Можно выделить пять основных жизненных циклов Д. 1. Асексуальный - мейоз не обнаружен, могут образовываться вегетативные споры. Характерен для дейтеромицетов. 2. Гаплоидный - вегетативная фаза гаплоидная, образование зиготы ведет к немедленному мейозу (см.) и споруляции. Споры гаплоидные, при их прорастании возникают гаплоидные клетки. Встречаются у шизосахаромицетов и у Saccharomyces elegans. 3. Гаплоидный с дикарионом (клетка с двумя ядрами) - напоминает предыдущий цикл, но перед слиянием ядер существует стадия дикариона, к-рая может иметь разную продолжительность. Классический тип встречается у Rhodosporidium и Leucosporidium, видоизменения - у некоторых аскомицетов. 4. Гаплоидно-диплоидный - клетки в обеих фазах могут размножаться вегетативно; диплоидизация происходит либо при слиянии клеток противоположных типов спаривания (гетероталличные культуры), либо при изменении условий роста. Встречается у некоторых аскоспоровых Д. 5. Диплоидный - в гаплоидной фазе находятся только аскоспоры и в некоторых случаях первые поколения клеток после прорастания спор; затем происходит диплоидизация. Диплоидизация может происходить путем слияния дочерних ядер в прорастающей споре, слияния прорастающих спор, слияния клеток противоположного типа спаривания или слияния гаплоидной клетки и споры. В трех последних случаях за плазмогамией следует слияние ядер. У Д. этого типа гибридизация легко осуществляется смешиванием аскоспор у гомоталличных штаммов (без выраженной половой дифференциации) , вегетативных клеток противоположных типов спаривания у гетероталличных штаммов (с половой дифференциацией) или вегетативных клеток со спорами при гибридизации гетероталличного штамма с гомоталличным. У Д. родов Saccharomyces и Hansenula возможна внутри- и межвидовая гибридизация. В отдельных случаях выделены межродовые гибриды. У сахаромицетов можно получить полиплоидные гибриды.

Гаплоидизация у Д. сопровождается образованием мейотических (половых) спор. У дрожжей-аскомицетов споры заключены в аске (сумке). Их форма, величина и количество являются видовым признаком.

В ряде случаев половые споры формируются в строго определенных условиях окружающей среды, что затрудняет установление жизненных циклов и приводит к накоплению множества родовых и видовых синонимов. Для определения вида Д. необходимо получить морфол., репродуктивные и некоторые физиол, характеристики, к к-рым относятся форма вегетативных клеток, наличие и тип мицелия, форма спор и асков (рис. 2), сбраживание сахаров, ассимиляция разнообразных источников углерода и азота, осмо- и антибиотикоустойчивость, температурный максимум роста, потребность в витаминах, расщепление жиров, образование органических к-т.

Для роста Д. более благоприятны кислые субстраты, поэтому для их выделения используют среды с pH 4,6 ис 1% глюкозы. В среду часто добавляют противобактериальные антибиотики. Оптимальная температура выращивания 25-30°.

В природе Д. встречаются практически везде, но большинство видов имеет определенные места обитания: на ягодах и фруктах встречаются сахаромицеты, в морской воде, рассолах и копченых продуктах - дебариомицеты, которые могут расти при содержании NaCl до 24%; на субстратах с высоким содержанием сахара (мед, варенье) развиваются некоторые виды Zygosaccharomyces. Debaryomyces formicarius обитает только в муравейниках. Все виды Lipomyces выделяются лишь из почв. Дейтеромицеты (Candida, Trichosporon) часто обнаруживают на коже и слизистых оболочках здоровых людей. Штаммы, выделенные у людей, условно патогенны.

Среди заболеваний, вызываемых Д., наиболее часто встречаются кандидозы (см.) - поражение кожи, ногтей, слизистой оболочки ротовой полости, глотки, бронхов, легких, жел.-киш. тракта, гениталий или септическая форма. Возбудители (в порядке уменьшения встречаемости патогенных штаммов): Candida albicans, С. stellatoidea, C.tropicalis, C.pseudotropicalis, C.parapsilosis, C. guilliermondii. Эти Д. в тканях и выделениях обнаружены в виде почкующихся клеток или септированного мицелия. В культуре Candida albicans образуют хламидоспоры, в отличие от остальных потенциально патогенных видов.

Одним из возбудителей геотрихоза (см. Плесневые микозы) - заболевания слизистых оболочек - является Trichosporon cutaneum (син. Geotrichum cutaneum). Он образует прямоугольные клетки и септированный мицелий с артроспорами. Штаммы этого вида вызывают поражение толстой кишки и легких. Возбудитель криптококкоза (см.) Cryptococcus neoformans (син. Filobasidiella neoformans) поражает ц. н. с. и различные органы. Его вирулентность связана с полисахаридной капсулой, отсутствующей у невирулентных штаммов. Из споровых Д. известен лишь вид Debaryomyces klockeri (син. Deb. hansenii), выделяемый иногда при североамериканском бластомикозе (см.), однако не выяснено, патогенен ли этот вид или только сопутствует основному возбудителю Blastomyces dermatitidis. Дрожжевые микозы часто развиваются при авитаминозах, употреблении антибиотиков, подавляющих нормальную бактериальную микрофлору, применении кортикостероидов и цитостатических препаратов.

Для выделения патогенных Д. используют среду Сабуро, картофельный, кукурузный и кровяной агар, на которых Д. формируют разнообразные колонии (рис. 3). Для наблюдения клеток Д. весьма удобны прижизненная фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия, а также витальная окраска нейтральротом. Дрожжи родов Candida и Trichosporon определяют в нативных препаратах, капсула возбудителя криптококкоза хорошо видна в капле туши. Мазки окрашивают по Граму, все Д. грамположительны. Определяют Д. по таксономическому справочнику Лоддер (J. Lodder, 1970). Приемы выделения патогенных Д. описаны Н. П. Ели-новым.

Д., помимо основного использования В хлебопекарной и пивоваренной промышленности, могут применяться как ценный питательный продукт, дополнительный источник высокоценного белка (см. Белки одноклеточных), витаминов группы В и D и минеральных веществ. Д. могут сыграть важную роль в повышении уровня белка в питании населения многих стран мира, испытывающих выраженную белковую недостаточность.

Особую ценность и перспективность в питании человека имеет чистый белок - изолят, получаемый из Д. Будучи освобожден от всех нежелательных и небезразличных для организма веществ (нуклеиновых к-т, пуринов и др.), изолят Д. может широко использоваться для производства белковых концентратов, искусственных пищевых продуктов, а также для обогащения белком натуральных пищевых продуктов (хлеба, муки, крупы и др.).

Хим. состав Д. зависит от вида и расы грибка, состава питательной среды, условий культивирования и ряда других факторов.

Сухие пищевые Д. содержат 50% белка, 25-40% углеводов и до 3% жира.

Все виды Д. отличаются высоким содержанием азотистых веществ. Содержание азота в сухих Д. составляет в среднем 7-9% (на сухой вес). Из этого количества 18-20% приходится на небелковый азот, при этом 8-13% составляют пуриновые основания, ок. 4% - пиримидиновые основания, 0,5% - глюкозамин и др.

Белок Д. характеризуется сбалансированностью аминокислот, близкой к животному белку, за исключением содержания метионина, которого в 2-3 раза меньше, чем в белке мяса и других животных продуктов (табл.).

Таблица. Содержание незаменимых аминокислот в некоторых видах продуктов из дрожжей

Наименование продукта	Аминокислоты в процентах к общему азоту
	триптофан		метионин		изолейцин
Снятое молоко
Говядина
Дрожжи «углеводные»
Дрожжи «нефтяные»
Дрожжи «газовые»

Примечание. К «углеводным» относятся все виды Д. пищевого предназначения; «нефтяные» и «газовые» Д., находящиеся в стадии изучения, относятся к кормовым Д.

Несмотря на сравнительно невысокое содержание метионина, белок Д. является высокоценным; в смешанной диете в сочетании с белками других продуктов, напр, мяса и молока, он может служить существенным источником лабильных метильных групп, обеспечивающих синтез холина в организме. Белок Д. хорошо переваривается и усваивается. Так, перевариваемость пекарских Д. составляет ок. 80%, пивных - 80-91%, кормовых - 85-88%. Перевариваемость сухих Д. в организме человека 70-90%.

Д. относятся к наиболее богатым источникам витаминов группы В, витамина D. Они содержат эргостерол, способный при облучении УФ-лучами образовать ряд кристаллических веществ, в т. ч. и кальциферол (витамин D2). Содержание эргостерола в Д. составляет 0,6% (на сухое вещество). Д. широко используются витаминной промышленностью для производства препаратов витамина D.

В состав жира Д. входят преимущественно пальмитиновая (75%) и стеариновая (25%) к-ты, фосфатиды, а также эргостерин, количество к-рого в некоторых видах Д. достигает 2% к общему количеству жира.

В составе фосфатидов Д. находятся (в процентах к общему количеству фосфатидов) фосфатидилсерин - 26%, кефалин - 31%, нейтральные жиры - ок. 30%, мезокефалии - 13%, сфингомиелин - 1%.

Количество минеральных солей в Д. колеблется в зависимости от условий их культивирования; содержание их в процентах солеобразующих окислов следующее: K 2 O - 29,33-39,5; Na 2 O - 0,5-2,26; CaO - 1,0-7,5; MgO - 3,77-6,34; Fe 2 O 3 - 0,06- 0,7; P 2 O 5 - 44,8-59,4; SO 3 - 0,57- 6,38; SiO 2 - 0,92-1,88.

Д. используют для приготовления кулинарных и хлебобулочных изделий (см. Хлеб, хлебопродукты). Для повышения их питательной ценности можно добавлять Д. в количествах, значительно превышающих нормы хлебопечения. Для усиления белкового и витаминного питания рекомендуются сухие Д.- 10-25 г в сутки. Увеличивать эти нормы нецелесообразно, т. к. Д. содержат относительно много пурина и систематическое потребление их в большом количестве (особенно в пожилом возрасте) может отрицательно сказаться на состоянии организма.

При использовании Д. в питании необходимо учитывать возможность присутствия в них ряда нежелательных веществ, в т. ч. малоизвестных и недостаточно изученных. К ним относятся необычные компоненты липидной фракции (стерины, ненасыщенные жирные к-ты и др.), некоторые аминокислоты, в т. ч. их D-оптические изомеры аминосахаров и пептидов, особенно в составе клеточных мембран, а также ряд других биологически активных веществ известной и неизвестной природы. Только одно разрушение клеток Д. уже приводит к улучшению качества продукта и повышению усвояемости белка Д. Обработка Д. в среде органического растворителя освобождает их от липидных и других нежелательных компонентов. Отделению подлежат также нуклеиновые к-ты.

При использовании Д. в питании их нужно инактивировать путем интенсивной тепловой обработки (проваривание, прожаривание). Инактивированные Д. добавляют в различные блюда - овощные и крупяные первые блюда, в запеканки, оладьи, котлеты, жаркое, соуса и др. Для пищевых целей используют Д. прессованные, сухие и жидкие.

Для мед. целей наибольшее практическое применение получили пивные Д., как свежие - жидкие, так и сухие. Согласно стандарту (ГОСТ 171 - 69) влажность прессованных Д. должна быть не более 75%, кислотность (в пересчете на уксусную к-ту, в мг): в день выпуска Д. с завода - не более 120, а после 12 сут. хранения или транспортировки при t° 0-4° - не более 360 на 100 г д.

Сухие Д. получают путем обезвоживания прессованных Д. Сухие мед. пивные Д. поступают в торговую сеть в виде порошка. По органолептическим свойствам они должны иметь специфический дрожжевой запах без посторонних примесей, без признаков плесени и разложения органических веществ. Влажность их не должна превышать 10%, количество белковых веществ - не ниже 50% и золы - не более 10% на сухое вещество. Используя современные технологические методы производства, можно получить высокоактивные сухие Д., сохраняющие активность в течение длительного срока.

Жидкие Д.- крайне нестойкий продукт, подлежащий реализации в течение первых 6-8 час. Для удлинения срока хранения и возможности транспортировки жидкие Д. можно подвергать специальной обработке путем уваривания и добавления соли.

Д., особенно прессованные и жидкие, относятся к скоропортящимся продуктам, требующим строгого ограничения сроков хранения при t° 0-4°. Прессованные Д. допускается хранить при t° 0-4° в течение 10-12 сут., жидкие и питьевые - 6-8 час., дрожжевую пасту - ок. 3 сут.

Д. находят применение в некоторых отраслях пищевой промышленности. В кондитерской и сахарной промышленности Д. могут использоваться как источник инвертазы- фермента, осуществляющего инверсию сахарозы.

Особое значение имеют Д. для повышения пищевой ценности галет и печенья путем обогащения их дрожжевым белком и группой витаминов В.

Галеты, обогащенные Д., содержат в 1 кг: белка - 105 г, жира - 70 г, витамина B1 - 9-12 мг, B2 - 7-9 мг, PP - 90-95 мг, фолиевой к-ты - 75-80 мг, холина - 4300 мг и другие витамины группы В. Кроме того, белок таких галет содержит повышенный комплекс незаменимых аминокислот.

Исследование Д. производят путем определения органолептических показателей и лабораторного анализа - согласно методике, приведенной в соответствующих стандартах (ГОСТ 171 - 69).

Большое значение имеет производство Д., источником энергии которых служат нормальные парафины и углеводороды.

Это открывает большие возможности для применения углеводородных Д. в качестве важного источника кормовых ресурсов и в перспективе для питания человека.

Лечебное применение дрожжей

Пищевые Д.- весьма ценный продукт для здорового и больного человека. Они имеют важное значение в профилактике алиментарной дистрофии и многих заболеваний, связанных с белковой недостаточностью.

Д. нашли широкое применение при лечении больных алиментарной дистрофией, выздоравливающих после тяжелых заболеваний (острые инфекции, ожоги, травмы), больных, страдающих хрон, заболеваниями (туберкулез, бруцеллез, ревматизм и др.), а также больных пеллагрой, спру, бери-бери, анемией, фурункулезом и др. При этом преследуется цель повышенного введения в организм с рационом полноценного белка, витаминов, особенно тиамина и рибофлавина.

Дозировка Д. может быть различной в зависимости от состояния здоровья больных и от степени белковой и витаминной недостаточности. Суточная доза для взрослых 50 г прессованных или 25 г сухих. Для детей младших возрастов- 25-30 г прессованных или 10 г сухих Д. в сутки.

Пекарские Д. вводят в первое и второе блюдо или закуски либо из Д. готовят дрожжевой напиток или специальные сорта хлеба. Сухие и прессованные Д. перед закладкой в изготовляемые блюда необходимо подвергнуть тепловой обработке.

Прессованные пищевые Д. кладут в соответствующую посуду (кастрюлю), в к-рую добавляют воду и соль из расчета 30 г воды и 15 г соли на 1 кг Д. Посуду с Д. ставят в другую посуду с горячей водой и варят под крышкой в течение 1 часа, после чего посуду с Д. ставят на горячую (но не раскаленную) плиту и варят еще 1 час при постоянном помешивании. При этом способе тепловой обработки прессованные Д. теряют присущий сырым Д. запах и вкус; происходит также разрушение дрожжевых клеток и бродильных элементов. Сухие пекарские Д. подвергают такой же тепловой обработке, но с предварительным разведением их холодной водой из расчета 4 л воды на 1 кг сухих Д. Жидкие Д. выпаривают до состояния густой пасты. Подвергшиеся тепловой обработке Д. закладывают в изготовляемые блюда и соусы. Во вторые блюда можно добавлять прожаренные Д. При высоких температурах Д. дают резкий, неприятный запах, поэтому в качестве белкового обогатителя используют комплексный дрожжевой ферментный препарат, который готовят из отмытых Д., обработанных ультразвуком. Под действием ультразвука дрожжевые клетки распадаются, а аминокислоты, ферменты, витамины и другие вещества остаются в неденатурированном виде. Комплексный дрожжевой ферментный препарат широко используют в хлебопекарной промышленности и для приготовления различных блюд.

Пивные Д., в которых содержатся безазотистые и азотистые вещества, ферменты и витамины (B 1 , B 2 , PP, а также провитамин D - эргостерин), используют для мед. целей в сухом виде при гиповитаминозе В 1 , фурункулезе, а также при различных нарушениях обмена веществ, сопровождающихся витаминной недостаточностью. Из высушенных пивных Д. готовят р-р с сахаром, содержащий не менее 3 мг% витамина B1. Выпускают этот р-р во флаконах по 0,5 л и назначают внутрь по 1 чайн. л. 2-3 раза в день взрослым и 1 - 2 раза в день детям.

С леч. целью применяют также сухие пивные Д. (содержание витамина B 1 не менее 14 мг%). Сухие пивные Д. иногда назначают вместе с фитином (таблетки гефефитина, содержащие 0,375 г сухих пивных Д. и 0,125 г фитина) по 2-3 таблетки 2-3 раза в день.

Противопоказание для применения Д.- заболевания, при которых нужно ограничивать в рационе экстрактивные вещества (заболевания почек с синдромом хрон, почечной недостаточности, подагра, хрон, сердечно-сосудистая недостаточность и др.), а также индивидуальная непереносимость Д.

Библиография: Бирюзова В.П. Мембранные структуры микроорганизмов, М., 1973, библиогр.; Генетические основы селекции микроорганизмов, под ред. С.И. Алиханяна, с. 59, М., 1969, библиогр.; E л и н о в Н. П. Патогенные дрожжеподобные микроорганизмы, М., 1964, библиогр.; P h a f f H. J., Miller M. W. a. M r a k E. M. The life of yeasts, Cambridge, 1966; The yeasts, A taxonomic study, ed. by J. Lodder, Amsterdam - L., 1970; The yeasts, ed. by A. H. Rose a. J. S. Harrison, v. 1-3, L."- N. Y., 1969-1971.

Г. Ф. Нестерова, Я. О. Соом: К. С. Петровский (пит.), М. А. Самсонов (леч. применение).

Форма и размеры. Клетки дрожжей имеют разнообразную форму: круглую, овальную или эллиптическую, лимонообразную, цилиндрическую, иногда сильно вытянутую в виде гифов.

По сравнению с другими микроорганизмами дрожжи являются довольно крупными формами. Диаметр клеток дрожжей достигает 1-8 мкм, длина- 1-10 мкм. При таких размерах клеток поверхность их в 1 л сбраживаемого виноградного сока может достигать 10 м2. Именно такая большая поверхность клеток дрожжей определяет интенсивность их метаболизма и процесса обмена веществ с окружающей средой. Масса дрожжевых клеток, равнозначная по массе животному (500 кг), за сутки синтезирует более 50 т белка, а животное - всего около 0,5 кг.

Плотность (удельный вес) клеток дрожжей мало отличается от плотности бактериальных клеток. Относительная плотность бактериальных клеток составляет от 1,050 до 1,112; дрожжевых - от 1,055 до 1,060 .

Морфологически неизменные формы клеток дрожжей наблюдаются только у молодых культур на стандартной питательной среде. Одна и та же культура дрожжей может состоять из кле-

ток, различающихся по форме и размерам, особенно в зависимости от стадий развития и условий окружающей среды. Так, хересные дрожжи в период брожения, как правило, крупные, имеют эллиптическую или круглую форму клеток, тогда как в стадии образования пленки они становятся мельче, приобретают более вытянутую конфигурацию . Дрожжи рода Hansenula, обычно образующие пленку на поверхности вина из скоплений клеток сильно вытянутых, мелких, при развитии в среде с ограниченным доступом воздуха, например на дне бутылки, становятся крупнее, круглой формы. Форма и величина клеток дрожжей при введении СО2 в среду значительно изменяется. Размеры клеток пивных дрожжей (Sacch. carlsbergensis) увеличиваются и„ наоборот, клетки слабо бродящих дрожжей (Torula latvica) становятся значительно мельче .

Структура. Клетка дрожжей имеет сложное строение и состав. Размеры отдельных элементов ее находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Значительные успехи, достигнутые в настоящее время в расшифровке структур клетки дрожжей и их функций, основаны на новых методах исследования - электронной микроскопии и комплексной цитологии.

Дрожжевая клетка является одноклеточным микроскопическим организмом и имеет в основном то же строение, что и клетки животных и растений (рис. 16, 17). Внутри клетки содержатся компоненты, которые обычно подразделяются на органеллы и включения. К органеллам относятся клеточная оболочка, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, митохондрии, вакуоли, аппарат Гольджи, ядро. Включения - это временные образования клетки (гликоген, трегалоза, жир, метахроматин и др.К которые появляются и исчезают в процессе обмена веществ.

Клеточная оболочка - плотная, тонкая и эластичная, окружает цитоплазму и придает характерную форму клетке дрожжей, защищает ее от вредных факторов среды, несет электрический заряд. Оболочка поддерживает внутриклеточное осмотическое давление, регулируя поступление в клетку через поры солей и других низкомолекулярных соединений.

В химический состав клеточной оболочки входят белково-нолисаха-ридные комплексы, фосфаты и липиды. У Sacch. cerevisiae полисахаридная часть комплекса состоит примерно из равных количеств глю-кана и маннана, сумма которых составляет около 90% от сухой массы оболочки; остальное количество ее приходится на долю белка, липидов, глюкозамина . Белковые комплексы насыщены дисульфидными и сульфгидрильными группами. Липиды в основном (примерно на 2/3) состоят из свободных жирных кислот (олеиновой, пальмитолеиновой, пальмитиновой и стеариновой); остальную часть их представляют триглицериды, стерины и фосфолипиды.

В клеточных оболочках других видов дрожжей содержится глюкан, который не всегда связан с маинаном. Маннан может содержаться в клеточных оболочках дрожжей в небольших количествах (Sacch. guttulata и Endomycopsis capsularis), или совсем отсутствовать (Nadsonia fulvescens, Schizosaccharomyces). Оболочки клеток дрожжей, лишенные маннана, за исключением видов рода Schizosaccharomyces, содержат повышенные количества хитина.

В области периплазмы, которая находится между внутренней поверхностью клеточной оболочки и внешней поверхностью цитоплазматической мембраны, найден ряд ферментов. В основном это гидролитические ферменты, в том числе (3-фруктофуранози-даза (инвертаза) и кислая фосфатаза.

Обычно с составом клеточной оболочки связывают явление хлопьеобразования (флокуляции) дрожжей. Для дрожжей, так же как и для бактерий, установлено, что переход S-форм (гладких) в R-формы (шероховатые) и образование хлопьев в жидкой среде обусловлены превращением гидрофильных групп клеточной оболочки в гидрофобные . Однако анализ клеточных оболочек дрожжей, выделенных из хлопьеобразующих и нехлопьеобразующих штаммов Sacch. cerevisiae и Sacch. carls-bergensis, выращенных на синтетической среде, не выявил значительных различий в содержании основных компонентов, хотя по мере роста как у тех, так и у других количество маннана постепенно уменьшалось, а глюкана - увеличивалось. И лишь активная связь фосфоманнана и ионов кальция у двух соседних хлопьеобразующих клеток дрожжей может служить объяснением явления флокуляции .

Электронно-микроскопически также не обнаружены какие-либо особенности клеточных оболочек у флокулирующих дрожжей. По-видимому, эффект флокуляции дрожжей обусловлен наследственностью штамма.

Цитоплазматическая мембрана образует наружный слой цитоплазмы. Она окружает протопласт - отдельную структурную фракцию клетки, которую можно получить при удалении клеточной оболочки с помощью ферментов. Цитоплазматическая мембрана состоит из разных по плотности электронных слоев общей толщиной не более 10 нм тесно связанных с цитоплазмой. При микроскопировании в темном поле мембрану можно наблюдать в виде тонкого светящегося ободка.

В клетке микроорганизма цитоплазматическая мембрана осуществляет 4 основные функции : действует как осмотический барьер, регулирует проникновение питательных веществ из раствора в клетку и удаление продуктов обмена веществ, выполняет биосинтез некоторых составных частей клетки (компонентов клеточной оболочки), представляет собой место локализации некоторых ферментов и органелл (рибосомы).

Поступление (транспорт) веществ в клетку связано с изменением проницаемости мембраны, которая в свою очередь зависит от активности фосфолипазы и липазы .

Цитоплазма клетки дрожжей содержит все основные структуры, присущие высокодифференцированным клеткам, а именно: митохондрии, рибосомы, более или менее развитый эндоплазматический ретикулум (эндоплазматическая сеть), запасные вещества и другие внутриклеточные включения липоидной и углеводной природы. Они принимают активное участие в осуществлении важных ферментативных процессов в цитоплазме.

В результате электронно-микроскопических и биохимических исследований установлено, что цитоплазма представляет собой коллоидную систему, состоящую из белков, углеводов, липидов, минеральных веществ, воды и соединений других видов. По консистенции она характеризуется высоким показателем вязкости, превышающим вязкость воды в 800-8000 раз, что соответствует вязкости глицерина или густого сиропа. Вязкость цитоплазмы при старении клеток возрастает.

Структура цитоплазмы изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста клетки. Изменения цитоплазмы могут быть обратимые (паранекроз) и необратимые (некротические), что обусловлено степенью воздействия внешних факторов. У молодых клеток дрожжей цитоплазма гомогенна; при старении появляются вакуоли, зернистость, жировые капельки, гранулы полифосфатов и липоидов, т. е. цитоплазма становится гетерогенной.

При длительном дифференциальном центрифугировании цитоплазма делится на растворимую фракцию (клеточный сок) и на фракцию частиц, состоящую из мембран и рибосом. Растворимая фракция, заполняющая пространство между частицами в пнтактной клетке, является основным компонентом, который обеспечивает взаимодействие метаболитов с той средой, где находятся и функционируют структурные элементы. В растворимой фракции содержатся вещества с высокой молекулярной массой, преимущественно ферменты и транспортная РНК (тРНК), а также низкомолекулярные соединения, к которым относятся запасные углеводы, например, трегалоза и фонд (пул) аминокислот и нуклеотидов . В результате наличия в цитоплазме низкомолекулярных соединений возникает заметная разность в осмотическом давлении клеточного содержимого и наружной среды. Величина осмотического давления у дрожжей обычно составляет около 1,2 МПа .

Электронно-микроскопические исследования ультратонких срезов клеток показали, что цитоплазму пронизывает эндоплаз-матическая сеть (ретикулум), имеющая гранулярную или гладкую структуру. Тесный контакт ретикулума с другими компонентами клетки позволяет ему выполнять важную роль в обменных процессах клетки.

Одним из компонентов эндоплазматического ретикулума являются рибосомы. Это ультрамикроскопические плотные сферические гранулы. Они содержат почти равное количество РНК. и белка, незначительное - липидов. С функциональной особенностью рибосом связан синтез клеточных белков. На них происходит конденсация активированных аминокислот и укладка их в полипептидную цепь в соответствии с генетической информацией, переданной из ядра через информационную РНК .

Митохондрии - это высокоспециализированные обязательные мельчайшие органеллы дрожжевой клетки. Они обычно распределены равномерно между клеточной оболочкой и вакуолью. Их можно обнаружить не только в покоящихся клетках дрожжей, но и в клетках почкующихся, находящихся на различных стадиях роста и размножения, в почках и спорах. В монографии А. В. Котельниковой и Р. А. Звягильской «Биохимия дрожжевых митохондрий» рассмотрена подробно структурно-функциональная организация дрожжевых митохондрий.

Форме и размерам дрожжевых митохондрий присуща изменчивость. Длина их у различных дрожжевых организмов составляет от 0,2 до 7,5 мкм. По форме они могут быть в виде небольших гранул, палочек, нитей, цепочек.

Обычно число митохондрий в клетке колеблется от одной да 50. Но даже если в клетке присутствует всего одна митохондрия, она занимает не менее 20% объема клетки. В дрожжах Sacch. cerevisiae объем этих органелл может достигать 80% объема всей клетки. При низкой концентрации глюкозы в среде дрожжевая клетка содержит 100-200 митохондрий, при высокой - 30-40.

Митохондрии совершают свои функции при непрерывном перемещении с изменением размеров и формы, характеризуются быстротой и специфичностью реакции на изменения условий культивирования и физиологического состояния клетки.

Митохондрии отделены от цитоплазмы наружной двухслойной мембраной. Внутренняя мембрана образует выступы-кристы, чаще всего пузырчато-трубчатого строения. Пространство между кристами заполнено гомогенным веществом - матриксом. Слой внешней мембраны митохондрий, прилегающий к цитоплазме, имеет шероховатую поверхность и содержит перфорацию нерегулярного устройства.

Факт обязательного присутствия митохондрий в структуре клетки свидетельствует о локализации в них особых процессов, важных в обмене веществ. Дрожжевые митохондрии состоят главным образом из липидов - около 30% и белков - 65-70% сухой массы митохондрий, из которых около 25-35% находятся в форме структурного белка.

Дрожжевые митохондрии содержат ферменты, которые обеспечивают выполнение основной энергетической функции (окисление субстратов в цикле Кребса, перенос электронов через дыхательную цепь и окислительное фосфорилирование) - участвуют в сложном механизме воспроизведения митохондриальной ДНК, транскрипции и трансляции генетической информации, в биосинтезе фосфолипидов стеринов, в активации жирных кислот и др. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК) составляют количественно небольшой структурный компонент митохондрий.

Одним из наиболее значительных достижений молекулярной биологии последних лет считают обнаружение в митохондриях специфической ДНК . Митохондриальная ДНК (мДНК) существенно отличается от ядерного компонента ДНК клетки.

Вакуоли в дрожжевых клетках являются обязательным органоидом. Кроме растворенных в воде электролитов, в вакуолях содержатся в коллоидном состоянии белки, жиры, углеводы и ферменты. В вакуолях накапливаются: Na, К, Са, Mg, Cl, SO4 и РО4 в виде отдельных элементов и солей, причем концентрация их во много раз превышает содержание солей в окружающей среде .

Размеры и форма вакуолей в дрожжевых клетках подвержены значительным изменениям. В одной дрожжевой клетке их может быть или несколько, или одна - центральная вакуоль.

Вакуоли содержат разнообразные включения как в состояли раствора, так и в форме кристаллических или аморфных гранул и капель; pH сока вакуоли 5,9-6,0; осмотическое давление составляет величину, близкую осмотическому давлению 2,5- 3,5%-ных растворов хлористого натрия. Содержимое вакуоли обычно оптически пусто. Светятся лишь кристаллические и липо-идные включения, находящиеся в энергичном броуновском движении. В вакуолях протекают активные окислительно-восстановительные процессы .

Аппарат Гольджи (диктиосома) состоит из ряда двойных мембран, концентрически изогнутых. Иногда от концов мембран отшнуровываются круглые пузырьки, которые могут затем превращаться в крупные вакуоли. Считают, что функция аппарата Гольджи заключается в управлении общим ходом физиологических процессов.

Ядро является постоянным структурным компонентом дрожжевой клетки. В живых дрожжах ядра можно отчетливо наблюдать в клетках, пробывших несколько дней в стерильной воде, цитоплазма которых вследствие голодания становится более гомогенной и прозрачной, а также при флуоресцентной микроскопии после обработки дрожжевых клеток растворами флуоро-хромов и при фазово-контрастной микроскопии.

Ядро у дрожжей имеет оболочку, ядрышко (кариосому) и основное содержимое - кариоплазму. Оболочка принимает участие в регуляции внутриядерных процессов путем изменения проницаемости и непосредственных сообщений между ядром и внеклеточной средой и ядром и цитоплазмой .

Диаметр дрожжевого ядра около 2 мкм, чаще всего ядра имеют шаровидную или эллиптическую форму. Расположение их может меняться в процессе жизнедеятельности клетки.

Размеры дрожжевого ядра неодинаковы не только в клетках различных родов, но и в клетках одной и той же культуры при разном физиологическом состоянии. Крупные ядра с отчетливой кариосомой наблюдаются у дрожжей представителей родов Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Saccharomycodes. В противоположность им клетки, принадлежащие к слабо бродящим и небродящим дрожжам (Torulopsis pulcherrima, Т. utilis), имеют обычно относительно мелкие ядра. У растущих дрожжевых клеток ядра обогащаются нуклеиновыми кислотами и часто перемещаются в активные участки роста ближе к участкам, в которых происходит почкование или деление клеток.

Основным химическим ингредиентом ядра является ДНК. С нею и только с нею связана передача генетической информации от одного поколения клеток к другому. В состав ядра обязательно входит также РНК, но обычно в меньшем количестве, чем ДНК- Ядро содержит и белки, не связанные с нуклеиновыми кислотами. Молекулами ДНК и РНК обусловливаются синтез и особенности белков клетки. Поток генетической информации направлен от ДНК через РНК к белку (ДНК->РНК-белок).

0,18-0,17% в расчете на сухую биомассу. Содержание ДНК в дрожжевых клетках винных дрожжей после термической обработки почти не изменяется .

Нуклеотидный состав ДНК весьма специфическим образом зависит от вида организма. Однако число остатков аденина равно числу остатков тимина (т. е. А=Т), а число остатков гуанина равно числу остатков цитозина (Г = Ц), т. е. число пиримидиновых остатков равно числу пуриновых остатков (А + Г = Т + Ц). Близкие виды дрожжей имеют сходный нуклеотидный состав, а эволюционно отдаленные организмы весьма заметно различаются по этому показателю. Поэтому часто нуклеотидный состав ДНК используют как таксономический признак .

При размножении клеток в ядрах обнаруживаются структуры, содержащие ДНК,- хромосомы, которые у дрожжей можно видеть иногда на фиксированных препаратах при окраске . В хромосомах ДНК, связанная с белками-гистонами, образует нуклеопротеидные нити толщиной около 10 нм . Для конкретного вида дрожжей число хромосом, длина и форма их постоянны.

Однако данные о числе хромосом у дрожжей весьма противоречивы и пока не подкрепляются ни результатами электронномикроскопических исследований, ни генетическими данными .

В определенных условиях в природе и в эксперименте при воздействии различных химических и физических агентов число хромосом в клетке может изменяться. У гаплоидных клеток набор хромосом одинарный (п), у диплоидных - двойной (2 п). С увеличением числа хромосомных наборов возрастает содержание ДНК, увеличиваются размеры клетки, ее ядра и ядрышка. Гаплоидные клетки содержат точно половину того количества ДНК, которое обнаруживается в диплоидных.

Внутриклеточные включения и запасные вещества, находящиеся в цитоплазме и вакуолях клеток в процессе их жизнедеятельности,- это морфологически дифференцированные образования гранул гликогена, метахроматина (волютина), жироподобных веществ и капель жира, скоплений серы, кристаллов кислот и сахаров. Они находятся в клетке в осмотически инертной форме, обычно нерастворимы в воде.

Трегалоза (нередуцирующий дисахарид) и гликоген (полисахарид) содержатся в клетке в значительных пределах: трегалоза - от 20 до 150 мг, гликоген - от 30 до 100 мг на 1 г сухих веществ клеток. В дрожжах, выращенных в аэробных условиях, преобладает трегалоза, в то время как в дрожжах, взращенных анаэробно,- гликоген. С повышением температуры среды количество трегалозы в клетках увеличивается . Гранулы гликогена появляются в начале брожения и постепенно исчезают к концу. По современным сведениям, гликоген у дрожжей Sacch. cerevisiae локализован снаружи цитоплазматической мембраны в периплазматическом пространстве и связан с нерастворимыми компонентами клеточных оболочек.

Липиды (жиры и жироподобные вещества), являясь важными компонентами цитоплазматических мембран органоидов клетки, выполняют и роль запасного питательного материала. Жиры дрожжей представляют собой смесь истинных жиров (глицеридов жирных кислот) с фосфолипидами (лецитин, кефалин) и сте-ролами (эргостеролом). Капельки жира в клетках дрожжей хорошо различимы в световом микроскопе благодаря тому, что они сильно преломляют свет. Особенно хорошо они видны у пленчатых дрожжей.

Фосфолипиды наряду со стеринами, каротиноидами и сквале-нами способствуют росту дрожжей и выполнению биосинтетических реакций в анаэробиозе .

В зависимости от вида и условий культивирования дрожжи способны синтезировать от 1 до 74% липидов в расчете на сухую массу. Наибольшей способностью накапливать липиды в клетках обладают дрожжи Rhodotorula gracile. В клетках дрожжей этого рода количество липидов может достигать 74% сухой массы клеток.

Метахроматин (волютин), в состав которого входят преимущественно полифосфаты, находится в состоянии коллоидного раствора в вакуолях и без окраски или осаждения фиксаторами как правило неразличим. Однако иногда в результате каких-то отклонений в клеточном обмене веществ в вакуолях можно наблюдать метахроматин, частично выпавший из раствора в виде сферических гранул, хорошо преломляющих свет и энергично броунирующих. Метахроматин используется при построении клеточного протопласта и как источник энергии. Поэтому количество его уменьшается при активных синтетических процессах и увеличивается при задержанном размножении .

Сера, иногда содержащаяся в протоплазме дрожжей, обнаруживается по сильному преломлению света. Отложение серы в клетках дрожжей приводит к появлению инволюционных форм .

Клетки некоторых родов дрожжей (Rhodotorula, Sporobolo-myces salmonicolor) окрашены в оранжевый и красный цвета, обусловленные содержанием пигментов, принадлежащих к группе каротиноидов. Дрожжи рода Candida (С. pulcherrima, С. reu-kaufii) на средах, содержащих железо, образуют колонии темно-красного цвета за счет красного пиразинового пигмента, в состав которого входит комплексно-связанное железо.

Итак, в структуре дрожжевой клетки содержатся различные вещества, изменения которых в результате биохимических процессов должны быть идеально согласованы между собой.

Переход клеток дрожжей от аэробного существования к анаэробному (брожение) сопровождается укрупнением ядра и ка-риосом, уменьшением содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты; поверхность митохондрий по отношению к биомассе их вещества уменьшается; в клетках дрожжей бродильного типа обычно накапливаются метахроматин и гликоген.

Структура клеток дрожжей разных родов неодинакова. Установлено, что митохондрии, эндоплазматический ретикулум и оболочки клеток дрожжей Sacch. vini и Rhodotorula glutinis существенно различаются. Ультраструктурная организация клеток дрожжей Rh. glutinis более развита и специализирована, чем дрожжей Sacch. vini. У Rh. glutinis митохондрии более многочисленны, с более упорядоченной внутренней структурой, со значительно развитым и своеобразно построенным ретикулумом.

Открытие своеобразной формы полового поведения у митохондрий совместимо с теорией симбиоза. Генетическая рекомбинация у этих органелл гораздо больше напоминает половой процесс у фагов и бактерий, чем у ядер эукариот. Все четкие данные получены на Saccharomyces, так как дрожжи могут размножаться в чистой культуре, на среде определенного состава, как стабильные гаплоиды или диплоиды. В таких митотически делящихся клетках ядерный геном остается неизменным, и это позволяет следить за сегрегацией рекомбинантной ДНК, образующейся при скрещиваниях между маркированными родительскими митохондриями. Рекомбинация митохондриального генетического материала происходит у дрожжей регулярно и часто независимо от мейоза.

Так как большинство других эукариот не переносит серьезных нарушений функционирования митохондрий и не может расти без полового процесса в виде одиночных гаплоидных или диплоидных клеток, генетическое поведение их митохондрий исследовать не удается. Однако если результаты, полученные на дрожжах, можно экстраполировать на другие эукариотические организмы, то рекомбинация митохондрий должна быть обычным явлением. Ваши собственные органеллы, возможно, ведут свою тайную половую жизнь.

Уже построена генетическая карта митохондрий дрожжей. Почти половина охарактеризованных митохондриальных мутаций затрагивает белоксинтезирующую систему этих органелл: они выражаются в изменении резистентности к антибиотикам, изменении транспортных и рибосомных РНК. Другие мутации влияют на комплексы дыхательных белков, связанные с мембраной. Известно около 700 независимо выделенных митохондриальных мутантов. Комментируя половое поведение митохондрий дрожжей, Б. Дюжон (личное сообщение, 1978) писал:

«Я полагаю, что следует с осторожностью применять термин «пол» по отношению к митохондриям, но при том определении, которое Вы ему даете [регулярное образование индивидуумов, имеющих более одного родителя], я полностью согласен с употреблением этого термина. Интактные митохондриальные геномы дрожжей рекомбинируют столь активно, что после недолгого [асексуального] роста [стабильно диплоидных родительских дрожжей, образующихся в результате спаривания] возникают всевозможные множественные рекомбинанты [митохондрий]. Но следует отметить, что рекомбинация может происходить и между разными молекулами митохондриальной ДНК, происходящими от одного родителя, а не только между молекулами от разных родителей. Под словом «пол» часто также понимают половую дифференциацию, и хотя мы всегда говорим о «гомосексуальных» и «гетеросексуальных» скрещиваниях, нет никаких данных о существовании среди митохондрий двух (или нескольких) половых типов. По нашей терминологии «половой тип» - это тип, способный рекомбинировать только с противоположным половым типом. Система омега (ω), контролирующая полярность рекомбинации вблизи самого омега-локуса, вначале была принята за половой тип. Теперь мы знаем, что различие между ω + и ω — связано с включением определенной нуклеотидной последовательности (около 1000 пар) в точно локализованный участок митохондриальной ДНК. Наконец, в сознании многих исследователей существует параллель между митохондриальной наследственностью и материнской наследственностью [митохондриальные генотипы передаются потомству только одним родителем, обычно самкой или родителем, продуцирующим яйца]. Все наши результаты указывают на то, что у дрожжей оба родителя вносят равный вклад в передачу митохондрий потомству независимо от их ядерных половых типов… а, следовательно, нет смысла говорить об эффекте материнской наследственности. У других видов это, очевидно, не так».

Рекомбинацию у митохондрий обычно изучают, используя маркеры резистентности к антибиотикам или мутации белков, участвующих в дыхании и окислительном фосфорилировании. Первые, например резистентность к аминогликозидным антибиотикам, которые, как известно, подавляют рост свободноживущих и патогенных бактерий, присоединяясь к их рибосомам, считаются мутациями, затрагивающими митохондриальные рибосомы. Вторые, называемые мутациями mit — , представляют собой дефекты митохондриальных генов, кодирующих такие белки, как цитохромоксидаза, олигомицин - чувствительная мембранная АТРаза, цитохром b и различные редуктазы. Биологические особенности дрожжей и большое число митохондриальных маркеров обусловили возможность многофакторных скрещиваний, в которых можно одновременно прослеживать передачу многих митохондриальных генетических детерминантов. Более чем десятилетняя работа ряда исследователей позволяет нарисовать интереснейшую картину митохондриального полового процесса. Нижеследующее резюме основано в первую очередь на работе Дюжона и Слонимского.

Митохондриальная генетическая система мультигеномна: каждая дрожжевая клетка содержит несколько идентичных копий функциональной митохондриальной ДНК. Их число не фиксировано. Число генетически активных копий может варьировать в разных клетках одного штамма дрожжей; оно зависит также от внешних условий, таких как температура и присутствие различных веществ, и от скорости роста дрожжей. Межштаммовые различия в числе митохондриальных геномов на клетку по крайней мере частично определяются несколькими взаимодействующими ядерными генами. Спаривание и рекомбинация митохондриальных ДНК, по-видимому, происходит часто и случайным образом. Рекомбинация нереципрокна; действительно, число двойных рекомбинантов в двухфакторных скрещиваниях всегда более чем вдвое (часто намного более) превышает ожидаемое на основании реципрокной модели. Продукты рекомбинации быстро сегрегируют при митотическом делении клеток; клетка, содержавшая вначале по-разному маркированные митохондрии, через несколько делений дает дочерние клетки с митохондриями только одного типа. Причина этой сегрегации, которая происходит без добавления каких-либо селективных агентов, не ясна. В некотором смысле это проявление внутриклеточного отбора, при котором остальная часть клетки - нуклеоцитоплазма - служит для митохондрий внешней средой. Показано, что внутриклеточный отбор может приводить к сегрегации некоторых маркеров резистентности к антибиотикам. По-видимому, небольшое число сегрегирующих митохондриальных генетических единиц, содержащихся в каждой дрожжевой клетке, распределяется при митотическом делении случайно. Каждая сегрегирующая единица, очевидно, состоит из нескольких молекул ДНК. Организация этой ДНК не вполне понятна, но наиболее правдоподобная гипотеза состоит в том, что сегрегирующая единица - это группа молекул митохондриальной ДНК, прикрепленных в определенном месте к внутренней мембране митохондрии. Это согласуется с данными электронной микроскопии.

Можно сформулировать следующие общие правила наследственной передачи и рекомбинации митохондриальных маркеров у Saccharomyces cerevisiae.

1. Передача двух или большего числа аллелей различных локусов, если они получены от одного родителя (дрожжевой клетки), всегда происходит коррелированно. Часто, но отнюдь не всегда, наблюдается линейная корреляция; если корреляция нелинейна, ее вид предсказывается моделью Дюжона и Слонимского.

2. Верхний предел частоты рекомбинации между двумя маркерами 20-25%. Этот предел может быть превышен только тогда, когда два реципрокных рекомбинанта появляются с существенно разной частотой. Такое явление получило название полярности рекомбинации. Если полярность высока, максимальная частота рекомбинации может достигать 80%, причем в этом случае число типов рекомбинантов намного больше числа родительских типов.

3. Существует нелинейное функциональное отношение между частотой рекомбинации между двумя локусами и передачей аллелей каждого локуса. Вид этого отношения предсказывается моделью Дюжона и Слонимского.

4. В трехфакторных скрещиваниях, когда отсутствует полярность рекомбинации, число двойных рекомбинантов по крайней мере вдвое больше ожидаемого, равного произведению частот появления двух одиночных рекомбинантов.

Эти четыре правила позволяют построить физическую и генетическую карту митохондриальной ДНК дрожжей. Все мутации, подчиняющиеся этим правилам, локализуются в одной группе сцепления, т. е. в одной молекуле митохондриальной ДНК. Митохондриальный геном состоит из уникальных нуклеотидных последовательностей, разделенных повторяющимися последовательностями. Имеется 60-70 уникальных генов со средней длиной 530 нуклеотидов; они чередуются с повторяющимися последовательностями средней длиной 680 нуклеотидов. Каждая повторяющаяся последовательность состоит из спейсера, богатого АТ (около 600 нуклеотидов), короткого кластера примерно из 30 нуклеотидов ж кластера, богатого GC, длиной около 50 нуклеотидов. Спейсеры, богатые АТ, вероятно, играют важную роль в рекомбинации; две другие последовательности в составе повторов могут, помимо прочего, регулировать инициацию синтеза ДНК.

Подводя итоги, можно сказать, что митохондрии дрожжей представляют собой мультигеномную генетическую систему, претерпевающую много циклов спаривания и характеризующуюся высокой эффективностью генетической рекомбинации и случайной, но очень быстрой сегрегацией. Этот своеобразный «промискуитет»» - случайность рекомбинаций и быстрота сегрегации - напоминает генетическое поведение бактериофагов.

Однако в других отношениях митохондриальная ДНК не похожа на фаговую. Например, близко родственные штаммы дрожжей могут сильно различаться по объему, содержанию митохондриальной ДНК, не различаясь при этом по функции митохондрий. У близких штаммов даже нуклеотидный состав митохондриальной ДНК может быть разным, так что значительная часть этой ДНК должна быть избыточной для функционирования генома. Кроме того, как и у эукариот, митохондриальные гены имеют мозаичную организацию. Иначе говоря, генетический материал, кодирующий разные участки одного и того же белка, может находиться в обособленных отрезках ДНК, и соответствующие транскрипты объединяются путем сплайсинга. Эти и другие черты генетической организации митохондрий привели Бернарди к следующему заключению:

«Можно сделать два основных вывода… Во-первых, митохондриальному геному дрожжей свойствен эукариотический, а не прокариотический тип организации… Во-вторых, в такой системе, как митохондриальный геном дрожжей, где чередуются уникальные и повторяющиеся последовательности, чрезвычайно важную роль играют рекомбинации, основанные на гомологии повторяющихся участков. Это основной механизм дивергенции и эволюции геномов, который обеспечивает на несколько порядков величины более высокую скорость этих процессов, чем механизм, основанный на точечных мутациях».

Бернарди, видимо, полагает, что генетическая организация митохондрий сформировалась таким образом, чтобы их эволюция могла происходить быстрее. Однако нам кажется, что, каково бы ни было значение всех этих фактов для симбиотической теории, было бы неразумно объяснять их, наделяя эволюцию способностью к предвидению.

). Снаружи дрожжевые митохондрии отграничены от цитоплазмы наружной двуслойной мембраной , оба слоя которой либо непосредственно соприкасаются друг с другом, либо разделены осмиофобным пространством. Изнутри наружную мембрану выстилает внутренняя мембрана . Она образует выступы - тубулы и или настоящие кристы, чаще всего пузырчато-трубчатого строения, достигающие 150-200 А в толщину и состоящие из двух осмиофильных слоев, разделенных пространством в 50-100 А. Кристы могут идти неравномерно во всех направлениях и не обязательно параллельно длинной оси митохондрий, как это сообщалось первыми исследователями. Внутреннее пространство между кристами заполнено матриксом, который, как правило, менее плотен, чем окружающая органоид цитоплазма. Новая информация о некоторых деталях строения митохондриальной структуры была получена при использовании недавно развитой техники негативного контрастирования и скалывания замороженных образцов (freeze- etching), обеспечивающих высокое разрешение и стабильность препаратов. Метод негативного контрастировапия позволяет воссоздать трехмерную пространственную структуру дрожжевых митохондрий. На микрофотографии ( рис. 2) отчетливо видна ограничивающая внешняя мембрана и находящиеся под ней складки внутренней мембраны, расходящиеся под разными углами. Кроме того, с помощью метода негативного контрастирования фосфорно- вольфрамовой кислотой была обнаружена новая субструктура дрожжевых митохондрий - регулярно расположенные мелкие грибовидные образования, покрывающие всю свободную поверхность внутренней мембраны и крист, обращенную в матрикс митохондрий (см. рис. 3). Детальное рассмотрение ультраструктуры частиц показывает, что каждая состоит из головки сферической формы с d=70-80 А, стебля длиной 45-50 А и шириной 20-40 А и базальной части, представляющей собой сегмент внутренней мембраны митохондрий. Аналогичные структуры найдены в митохондриях из других источников и, по- видимому, характерны для всех мембран, катализирующих окислительное фосфорилирование. Особенно плодотворным для изучения ультратонкой структуры дрожжевых митохондрий оказался метод фиксации клеток замораживанием [см. Фихше ea 1973 , Фихше ea 1973 ]. Модификации этого метода, основанные на сверхбыстром замораживании клеток с последующим нанесением реплик на обнаженные поверхности [см. Фихше ea 1973 , Фихше ea 1973 ], позволили выявить детали, не распознаваемые с помощью обычных методов фиксации. Так, с помощью этого метода показано, что митохондриальные мембраны содержат глобулярные частицы, упаковка которых носит уникальный характер. Слой внешней мембраны, прилегающий к цитоплазме, имеет характерную шероховатую поверхность и содержит перфорации ("поры") нерегулярного устройства, что предполагает возможность контакта между цитоплазмой и перимитохондриальным пространством. При протравливании препаратов парами платины на этой поверхности обнаруживаются многочисленные более мелкие, чем перфорации, частицы [см. Котельникова ea 1973 ]. Поверхности внешней и внутренней мембраны, разделенные незначительным пространством или примыкающие друг к другу, относительно гладкие и содержат лишь рыхло упакованные частицы. На поверхности внутренней мембраны, обращенной к матриксу, четко выявляются глобулярные, относительно плотно упакованные частицы, сопоставимые по своим размерам с теми, что видны при негативном контрастировании. Новые структурные элементы обнаружены и в матриксе. Они имеют форму непрерывной фиброзной сети с нерегулярными плотно упакованными гранулами и областями с концентрацией полос или борозд, представляющих собой, вероятно, также плотно упакованные частицы [см. Фихше ea 1973 , Фихше ea 1973 ].

Результаты структурного анализа хорошо коррелируют с биохимическими доказательствами локализации в матриксе высокополимерной ДНК и сложно организованных полиферментных комплексов и с данными о различном составе и функциональной нагрузке внешней и внутренней митохондриальных мембран (см. разд. 1.3). Как правило, митохондрии дрожжей содержат меньше крист и имеют тенденцию к нерегулярности в очертаниях, устройстве, форме и упаковке их, т. е. характеризуются менее упорядоченной и жесткой структурой, чем более сложные митохондрии высших организмов. Внутренняя митохондриальная мембрана варьирует от настоящих крист до тубулей и обнаруживает удивительную вариабельность в структурных деталях в зависимости от специфики обмена, условий культивирования и фазы роста дрожжевых клеток. Дрожжи с ярко выраженным аэробным типом обмена - облигатные аэробы и слабо бродящие факультативные анаэробы - отличаются развитым мембранным аппаратом и содержат большое число сложно структурированных митохондрий с многочисленными кристами. У бродящих видов дрожжей мембранный аппарат выражен слабо, имеются лишь немногочисленные крупные митохондрии с неправильно ориентированными кристами; у дрожжей низового брожения кристы рудиментируются. Однако следует подчеркнуть, что тонкая структура митохондрий не остается постоянной даже у одного и того же организма (особенно у факультативных анаэробов), а меняется в зависимости от физиологического состояния, фазы роста и условий культивирования. Поэтому перечисленные выше характерные морфологические особенности относятся лишь к вполне "сформировавшимся" митохондриям в клетках, собранных в поздней экспоненциальной или стационарной фазах роста. Те же клетки в экспоненциальной фазе роста или при выращивании на среде с высокой концентрацией глюкозы обладают немногочисленными митохондриями со сравнительно простой внутренней организацией. Нередко полиморфизм митохондрий можно наблюдать даже в пределах одной клетки. Еще большая вариабельность отмечена для формы и размеров митохондрий. И это неудивительно, так как функционирование митохондриального аппарата, как известно еще из прижизненного наблюдения с использованием цейтраферной съемки, происходит в условиях его непрерывной подвижности, сопровождающейся изменением размеров и форы. В процессе движения митохондрии могут собираться в крупные агрегаты или, наоборот, распадаться на более мелкие образования. Характерная ориентация и направленное движение митохондрий, иногда сопровождающиеся агрегацией в специфические формы, происходит при делении и почковании дрожжевых клеток.

Однако обнаружение актина в митохондриях [ Ethoh ea 1990 ] и подавление антагонистами кальмодулина , зависимого от дыхания набухания митохондрий, дает основание полагать, что некоторые функции подвижности митохондрий могут контролироваться эндогенными (собственными) Са2+ зависимыми системами.